土壤磷酸酶的分光法测定方案

引言

磷酸酶能酶促有机磷化合物的水解。试验表明，土壤微生物对于土壤含磷有机物的矿化起着主要的作用;某些高等植物的根系也有磷酸酶活性。土壤的磷酸酶活性可以表征土壤的肥力状况（特别是磷的状况)。

原理

土壤磷酸酶活性的测定常用各种磷酸酯作为基质。应用得最多的是酚酞磷酸酯、苯磷酸酯、甘油磷酸酯、a-或B-萘磷酸酯和p-硝基苯磷酸酯等的水溶性钠盐。当它们被酶促水解时，能析出无机磷和基质的有机基团。因此磷酸酶活性的测定时测定基质水解后的无机磷或酚的部分。这里介绍的方法是测定基质水解时生成的酚量。该法可用于测定各种磷酸酶的活性:碱性磷酸酶（用PH10的硼酸盐缓冲液)，中性磷酸酶（用PH7.0的柠檬酸盐缓冲液)，酸性磷酸酶（用PH5.0的乙酸盐缓冲液)

仪器及试剂

8868体育官网UV-1300紫外分光光度计

1)甲苯

2)0.5%磷酸苯二钠

3）硼酸盐缓冲液（PH9.6与PH10.0):称取12.404g硼酸(H,BO;）溶于700ml去离子水，

用稀NaOH溶液调节至PH10.0，用去离子水稀释至1000ml

4)氯代二溴对苯酮亚胺试剂:取0.125g 2,6-二溴苯酮氯酰亚胺，用10ml 96%的乙醇溶解，贮于棕色瓶中，存放在冰箱里。保存的黄色溶液未变褐色之前均可使用。

5）标准溶液:(a）母液: 1g 酚溶于蒸馏水中，并稀释至1000ml，溶液保存在暗色瓶中;

(b）工作液: 10ml溶液（a）稀释至1000ml ( 1ml含10ug酚>

6)0.3%硫酸铝溶液

标准曲线绘制

取1，3，5，7，9，11和 13ml酚工作液(b)，置于50ml容量瓶中，每瓶加入5ml缓冲液和4滴氯代二溴对苯酮亚胺试剂，显色后稀释至刻度，30min后比色测定。以光密度为纵坐标，浓度为横坐标绘成标准曲线。

操作步骤

1）取5g 风干土置于200ml 三角瓶中，用2.5ml甲苯处理2）处理15min后，加入20ml 0.5%磷酸苯二钠

3)将反应混合物置于37℃恒温箱中，培养24h后，在培养液中加100ml 0.3%硫酸铝溶液用致密滤纸过滤。

4)无土对照:不加土样，其他操作与样品实验相同。以检验试剂纯度，整个实验设置一个对照

5)无基质对照:对每个土样，设置以等体积的水代替基质，其他操作与样品实验相同。6）比色程序:

取滤液3ml置于50ml容量瓶中，然后按绘制标准曲线所述方法显色。用硼酸缓冲液时，呈现蓝色，在分光光度计上于660nm处比色。

结果计算

磷酸酶活性，以24h后1g土壤中释出的酚的毫克数表示:

酚(mg) =a ×8

式中，a——从标准曲线上查得的酚毫克数

8——换算成1g土的系数

以24h后1g土壤中释放出的酚的质量（mg）表示磷酸酶活性。

磷酸酶活性=(a样品一a无土一a无基质）×V×n/m

式中:a样品为样品吸光值由标准曲线求得的酚毫克数;

a无土为无土对照吸光值由标准曲线求得的酚毫克数;

a无基质为无基质对照吸光值由标准曲线求得的酚毫克数;

V为显色液体积;

n为分取倍数，浸出液体积/吸取滤液体积;

m表示烘干土重

仪器参数

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